MAKALAH KIMIA ANALISIS II

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS, FLUOROMETRI, DAN SPEKTROFOTOMETRI IR

Dalam analisis kimia dikenal berbagai macam cara untuk mengetahui data kualitatif dan kuantitatif baik yang menggunakan suatu peralatan optik (instrumen) ataupun dengan cara basah. Alat instrumen biasanya dipergunakan untuk menentukan suatu zat berkadar rendah, biasanya dalam satuan ppm (part per million) atau ppb (part per billion). Salah satu metode sederhana untuk menentukan zat organik dan anorganik secara kualitatif dan kuantitatif dalam sampel air, yaitu dengan metode spektrofotometri.

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron yang ada pada atom ataupun molekul yang bersangkutan.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai suatu perluasan pemeriksaan visual yang dengan studi lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh macam-macam zat kimia memperkenankan dilakukannya pengukuran ciri-ciri serta kuantitatifnya dengan ketelitian lebih besar.

B. RUMUSAN MASALAH

Rumusan masalah yang dibahas dalam makalah ini yaitu mengenai spektrofotometri UV-Vis, fluorometri, dan spektrofotometri Infra Red (IR).

C. TUJUAN

Tujuan dalam pembuatan makalah ini yaitu agar mahasiswa mengetahui dan memahami penjelasan mengenai spektrofotometri UV-Vis, spektrofluorometri, dan spektrofotometri Infra Red (IR).

BAB II

PEMBAHASAN

Spektroskopi merupakan ilmu yang mempelajari tentang interaksi gelombang elektromagnetik dengan benda. Spektrofotometri merupakan suatu perpanjangan dari penelitian visual dalam studi yang telah terinci mengenai penyerapan energi cahaya oleh spesi kimia, memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam perincian dan pengukuran kuantitatif. Alat yang digunakan dalam metode spektrofotometri disebut spektrofotometer. Spektrofotometer berfungsi untuk mengukur absorbansi suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi.

Menurut Karinda (2013), metode spektrofotometri dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran dengan spektrum yang tumpang tindih tanpa pemisahan terlebih dahulu. Karena perangkat lunaknya mudah digunakan untuk instrumentasi analisis dan mikrokomputer, spektrofotometri banyak digunakan di berbagai bidang analisis kimia terutama farmasi.

Menurut Liyana (2010), metode spektrofotometri selain dalam pekerjaan cepat, sederhana, praktis, murah juga cukup peka dan teliti serta mudah dalam menginterpretasikan hasil yang diperoleh. Metode spektrofotometri umumnya membandingkan absorbansi yang dihasilkan oleh suatu larutan yang diuji dengan absorbansi larutan baku.

A. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer.

Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi electron-electron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet meningkatkan energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton memungkinkan electron-electron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar ke orbital baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi.

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.

Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

Hukum Lambert Beer menyatakan hubungan linieritas antara adsorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Ada beberapa pembatasan dalam hukum Lambert Beer, yaitu :

- Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

- Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama

- Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut

- Tidak terjadi fluorosensi atau fosforisensi

- Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus :

A = ε.b.c
dimana :
A = absorban
ε = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi

Dalam penentuan kadar suatu sampel menggunakan spektrofotometri visibel perlu dibuat larutan standar. Pembuatan larutan standar diawali dengan pembuatan larutan baku dimana larutan baku merupakan larutan yang dibuat dari pengenceran larutan induk menggunakan pelarut tertentu, larutan ini berfungsi untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi yang lebih rendah. Tujuannya adalah untuk membuat kurva kalibrasi yang nantinya akan digunakan untuk menghitung kadar sampel.

Pada metode spektrofotometri, sampel diletakkan di dalam kuvet yang disinari oleh cahaya UV dengan panjang gelombang yang sama dengan molekul. Analisis dengan menggunakan metode ini memiliki hasil yang akurat. Karena alasan biaya, metode ini jarang digunakan.

Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai untuk data sekunder atau data pendukung. Pada analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis yang dapat ditentukan ada 2 yaitu :

• Pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis.

• Penentuan panjang gelombang maximum.

Sebelum melakukan analisis dengan spektrofotometri UV-Vis maka perlu dilakukan pemilihan panjang gelombang maksimum, hal ini dimaksudkan agar pada saat pengukuran absorbansi cuplikan nanti bias didapat absorbansi maksimum sehingga kepekaan yang diperoleh maksimum. Untuk keperluan analisis terlebih dahulu dibuat kurva kalibrasi.

Menurut Gandjar (2007), ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.

B. Fluorometri

Metode spektrofluorometri adalah suatu metode pengukuran berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala dari suatu molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Fluroresensi akan nampak jelas apabila penyerapan sinar pada daerah ultraviolet dan melepaskannya dalam daerah gelombang nampak. Apabila struktur molekul bahan organik dapat dipakai untuk memperkirakan spectrum serapannya, hal yang sama tidak dipakai untuk memperkirakan senyawa apa yang berfluorosensi. Tetapi ada sedikit petunjuk bahwa senyawa alifatis cenderung memecah sinar dan tidak berfluoresensi, senyawa aromatis yang berisi electron tertentu yang tidak ditempat normalnya akan berfluoresensi.

Radiasi yang dilepaskan dapat berkisar pada beberapa panjang gelombang, maka spectrum fluoresensi berupa kumpulan atau pita spectrum. Spektrum fluoresensi biasanya tidak tergantung panjang gelombang radiasi yang terserap. Spectrum fluoresensi hanya dapat memberikan informasi pada saat kurang dari 10-8 detik. Intensitas dapat berkurang antara 10 – 15 % apabila suhu sampel menurun dari 30^oC menjadi 20^oC, maka diperlukan pengatur suhu agar pengukuran dapat lebih tepat.

Pada fluorometri larutan zat disinari dengan sinar yang panjang gelombangnya di sekitar panjang gelombang penyerapan maksimum yang berasal dari lampu raksa atau lampu pijar yang telah disekat dengan filter. Intensitas fluoresensi diukur atau dibandingkan dengan intensitas larutan baku. Sinar fluoresensi dibebaskan dari sinar hamburan dengan melewatkan sinar melalui filter atau monokromator. Cara pengukuran pada daranya sama dengan cara spektrofotometri. Karena zat organik yang berfluoresensi mungkin terurai secara fotokimia, penyinaran harus dilakukan sesingkat mungkin. Oleh karena daerah dimana intensitas fluoresensi sebanding dengan kadar umumnya sangat sempit, maka perbandingan

tidak boleh kurang dari 0,40 dan tidak boleh lebih dari 2,50.

Keterangan :

a = pembacaan intensitas fluoresensi larutan baku

b = pembacaan intensitas fluoresensi larutan blangko untuk zat baku

c = pembacaan intensitas fluoresensi larutan uji

d = pembacaan intensitas fluoresensi larutan blangko untuk zat uji

Peralatan pokok spektrofluorometer adalah :

- Sumber spectrum yang kontinyu misalnya dari jenis lampu merkuri atau xenon.

- Monokromator (M1) untuk menyinari sampel dengan panjang gelombang tertentu.

- Monokromator kedua (M2) yang pada iradiasi konstan dapat dipakai menentukan panjang gelombang spectrum fluoresensi sampel.

- Detector berupa fotosel yang sangat peka misalnya fotomultiplier merah untuk panjang gelombang lebih besar dari pada 500 nm.

- Amplifier untuk mengandakan radiasi dan meneruskan ke pembacaan.

Keuntungan menggunakan spektrofluorometer yaitu dapat mengukur konsentrasi sampel yang rendah (pikogram). Kepekaan fluorimetri dapat diatur dengan penguatan aliran listrik yang terbentuk dari jalinan fotosel. Spektroflurorimetri sangat mungkin menggunakan spectrum pilihan yang lebih luas karena geseran Stokes dan adanya dua monokhromator yang dapat dipakai, atau untuk spectrum yang mengenai sampel dan yang lain untuk spectrum fluroresensi yang timbul. Untuk fluorimetri tidak diperlukan kuvet pembanding (referensi) tapi kurva kalibrasi tetap harus dibuat.

Kelemahan teknik fluorometri yaitu ketergantungan pada keadaan lingkungan dan tidak ada pegangan senyawa apa yang akan berfluoresensi. Masalah lain dalam fluorimetri adalah penghapusan (quenching) yaitu energi yang seharusnya dilepas sebagai sinar fluoresensi terserap oleh molekul lain. Atau sebaliknya bahan-bahan diluar sampel seperti bahan pencuci (detergent), minyak pelumas, kertas saring atau kertas lap dapat mempengaruhi pengukuran fluorimeter karena dapat melepas sinar fluoresensi sendiri.

Aplikasi Fluorometri yaitu :

- Analisa kualitatif, perbandingan spectrum fluoresensi dapat membantu pengenalan senyawa.

- Analisa kuantitatif, pengukuran dapat dilakukan pada kadar yang sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan, dan kepekaan tinggi. Bila panjang gelombang emisi dan eksitasi telah dipilih, maka dapat dibuat hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung dari tingkat konsentrasi senyawa. Hubungan tersebut berupa garis lurus (linier) pada konsentrasi sangat rendah. Apabila kadarnya terlalu tinggi, larutan tersebut tidak linier lagi karena akan menyerap sebagian sinar eksitasi.

- Uji enzim dan analisa kinetika, enzim hidrolase dapat dengan mudah diukur melalui kecepatan munculnya senyawa yang berflurosensi pada 450 nm.

- Reaksi NAD+ dan NADP+, enzim dapat dilihat dalam keadaan aslinya (invitro), misalnya kadar substrat enzim atau kofaktor yang sangat rendah.

- Uji struktur protein. Beberapa jenis protein mengandung khromofore yang berfluoresensi (misalnya tirosin dan FAD), maka protein juga berfluoresensi.

- Penunjuk fluoresensi dan uji struktur membrane, Sifat fluoresensi molekul berubah oleh gerak maupun arah gerak (polaritas) lingkungannya, maka deteksi senyawa fluoresensi dapat memberikan petunjuk lingkungannya.

- Mikrosspektrofluorimetri. Gabungan antara spektrofluorimetri dengan mikroskop dapat dipakai untuk menunjukkan tempat senyawa berfluoresensi pada sel yang mengikat cat fluoresensi.

C. Spektrofotometri IR

Spektrofotometri Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75–1.000 µm atau pada bilangan gelombang 13.000–10 cm^-1 dengan menggunakan suatu alat yaitu Spektrofotometer Inframerah.

Metode ini banyak digunakan pada laboratorium analisis industri dan laboratorium riset karena dapat memberikan informasi yang berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif, serta membantu penerapan rumus bangun suatu senyawa.

Agar terjadi peresapan radiasi inframerah, maka ada beberapa hal yang perlu dipenuhi, yaitu :

1) Absorpsi terhadap radiasi inframerah dapat menyebabkan eksitasi molekul ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi dan besarnya absorbsi adalah terkuantitasi

2) Vibrasi yang normal mempunyai frekuensi sama dengan frekuensi radiasi elektromagnetik yang diserap

3) Proses absorpsi (spektra IR) hanya dapat terjadi apabila terdapat perubahan baik nilai maupun arah dari momen dua kutub ikatan

Interaksi antara sinar infra merah dengan molekul hanya menyebabkan vibrasi, yaitu bergerak pada tempatnya. Dasar spektrofotometri infra merah digambarkan oleh Hook, dimana didasarkan atas senyawa yang teriri dari 2 atom atau diatom yang mana digambarkan dengan dua buah bola yang saling terikat oleh pegas seperti berikut:

Keterangan :

v = frekuensi vibrasi (cm-1)

c = kecepatan cahaya (cm/sec)

k = force constant of bond (dynes/cm)

m = massa atom (g)

Atom – atom di dalam molekul tidak dalam keadaan diam, tetapi biasanya terjadi peristiwa vibrasi. Hal ini bergantung pada atom – atom dan kekuatan ikatan yang menghubungkannya. Vibrasi molekul sangat khas untuk suatu molekul tertentu dan biasanya disebut finger print. Vibrasi molekul dapat digolongkan atas dua golongan besar, yaitu:

a. Vibrasi regangan (Streching), adalah peristiwa bergeraknya atom terus sepanjang ikatan yajng menghubungkannya sehingga akan terjadi perubahan jarak antara keduanya, walaupun sudut ikatan tidak berubah. Vibrasi regangan ada dua, yaiut regangan simetri (unit struktur bergerak bersamaan dan searah dalam satu bidang datar) dan regangan asimetri (unit struktur bergerak bersamaan dan tidak searah tetapi masih dalam satu bidang datar).

b. Vibrasi Bengkokan (Bending)

Jika sistem tiga atom merupakan bagian dari sebuah molekul yang lebih besar, maka dapat menimbulkan vibrasi bengkokan atau vibrasi deformasi yang mempengaruhi osilasi atom molekul secara keseluruhan. Vibrasi bengkokan ini terbagi menjadi empat jenis, yaitu: Vibrasi goyangan(rocking), vibrasi guntingan (Scissoring), vibrasi kibasan (Wagging), vibrasi pelintiran (Twisting).

Radiasi inframerah digolongkan atas 4 (empat) daerah, yaitu :

No.	Daerah Inframerah	Panjang Gelombang dalam µm	Bilangan Gelombang (cm^-1)	Frekuensi (Hz)
1	Dekat	0,78-2,5	13.000-4000	3,8-1,2 (10¹⁴)
2	Pertengahan	2,5-50	4000-200	1,2-0,06 (10¹⁴)
3	Jauh	50-1000	200-10	6,0-0,3 (10¹⁴)
4	Untuk analisis instrumen	2,5-1,5	4000-670	1,2-0,2 (10¹⁴)

Spektrofotometri IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Kesimpulan dalam makalah ini yaitu :

- Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer.

- Metode spektrofluorometri adalah suatu metode pengukuran berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala dari suatu molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Fluroresensi akan nampak jelas apabila penyerapan sinar pada daerah ultraviolet dan melepaskannya dalam daerah gelombang nampak.

- Spektrofotometri Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75–1.000 µm atau pada bilangan gelombang 13.000–10 cm^-1 dengan menggunakan suatu alat yaitu spektrofotometer inframerah.

B. Saran

Sebaiknya mahasiswa dapat memahami dengan baik tentang spektroskopi baik spektrofotometri UV-Vis, fluorometri, maupun Infra Red agar dapatmengaplikasikannya dengan benar.

DAFTAR PUSTAKA

Bashar, Y., 2013, Makalah Spektrofotometer, http://yazhid28bashar. blogspot.com/2013/04/makalah-spektrofotometer.html, diakses pada tanggal 19 Mei 2014.

Gandjar, I.B. & Abdul R., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Hal 252.

Harahap, A., 2013, Spektroskopi, http://www.sharemyeyes.com/2013/05/ spektroskopi. html, diakses pada tanggal 19 Mei 2014.

Ika, D., 2009, Alat Otomatisasi Pengukur Kadar Vitamin C dengan Metode Titrasi Asam Basa, Jurnal Neutrino, No. 2, Vol. 1.

Karinda, M., dkk, 2013, Perbandingan Hasil Penetapan Kadar Vitamin C Mangga Dodol Dengan Menggunakan Metode Spektrofotometri Uv-Vis Dan Iodometri, Pharmacon, vol. 2 no. 1, ISSN 2302 – 2493, Manado.

Liyana, D.E. & Djarot S., 2010, Optimasi pH Buffer dan Konsentrasi Larutan Pereduksi Natrium Tiosulfat (Na₂S₂O₃) Dan Timah (II) Klorida (SnCl₂) Dalam Penentuan Kadar Besi Secara Spektrofotometri UV – Vis, Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2010/2011, Institut Teknologi Sepuluh Nopember.

Putro, P.K. & Asmedi S., 1996, Studi Banding Analisis Silicon Di Dalam Bahan Bakar Uranium Silisida Secara Spektrofoometrik Dan Gravimetrik, Prosiding Presentasi Ilmiah Dasar Bahan Bakar Nuklir, ISSN 1410-1998.

Sudarmadji, S., 1996, Teknik Analisa Biokimia, Penerbit Liberty, Yogyakarta.

Triyati, E., 1985, Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak serta Aplikasinya dalam Oseanologi, Oseana, vol. X, No.1, ISSN 0216-1877, Jakarta.

Wanenoor, 2010, Penentuan Kadar Vitamin E Metode Flurometri, http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/ 2040190-penentuan-kadar-vitamin-metode-flurometri/, diakses pada tanggal 19 Mei 2014.

Wocono, 2013, Spektrofotometri Infra Merah, http://wocono.wordpress.com/2013 /03/03/spektrofotometri-infra-merah/, diakses pada tanggal 19 Mei 2014.

THE PHARMACIST

farmasi UHO

Rabu, 20 April 2016

spektro

BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG