MAKALAH KIMIA
ANALISIS II
SPEKTROFOTOMETRI
UV-VIS, FLUOROMETRI, DAN SPEKTROFOTOMETRI IR
Dalam analisis kimia dikenal berbagai macam cara untuk
mengetahui data kualitatif dan kuantitatif baik yang menggunakan suatu
peralatan optik (instrumen) ataupun dengan cara basah. Alat instrumen biasanya
dipergunakan untuk menentukan suatu zat berkadar rendah, biasanya dalam satuan
ppm (part per million) atau ppb (part per billion). Salah satu metode sederhana
untuk menentukan zat organik dan anorganik secara kualitatif dan kuantitatif
dalam sampel air, yaitu dengan metode spektrofotometri.
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam
kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik
secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi
dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut
spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan
inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan
adalah elektron yang ada pada atom ataupun molekul yang bersangkutan.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai suatu
perluasan pemeriksaan visual yang dengan studi lebih mendalam dari absorpsi
energi radiasi oleh macam-macam zat kimia memperkenankan dilakukannya
pengukuran ciri-ciri serta kuantitatifnya dengan ketelitian lebih besar.
Rumusan masalah yang dibahas dalam
makalah ini yaitu mengenai spektrofotometri UV-Vis, fluorometri, dan
spektrofotometri Infra Red (IR).
Tujuan dalam
pembuatan makalah ini yaitu agar mahasiswa mengetahui dan memahami penjelasan
mengenai spektrofotometri UV-Vis, spektrofluorometri, dan spektrofotometri
Infra Red (IR).
Spektroskopi
merupakan ilmu yang mempelajari tentang interaksi gelombang elektromagnetik
dengan benda. Spektrofotometri merupakan suatu
perpanjangan dari penelitian visual dalam studi yang telah terinci mengenai
penyerapan energi
cahaya oleh spesi kimia, memungkinkan
kecermatan yang lebih besar dalam perincian dan pengukuran kuantitatif. Alat yang digunakan dalam metode spektrofotometri
disebut spektrofotometer. Spektrofotometer berfungsi untuk mengukur absorbansi
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer
terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi.
Menurut
Karinda (2013), metode
spektrofotometri dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran dengan spektrum
yang tumpang tindih tanpa pemisahan terlebih dahulu. Karena perangkat lunaknya
mudah digunakan untuk instrumentasi analisis dan mikrokomputer,
spektrofotometri banyak digunakan di berbagai bidang analisis kimia terutama
farmasi.
Menurut
Liyana (2010), metode spektrofotometri selain dalam pekerjaan cepat, sederhana, praktis,
murah juga cukup peka dan teliti serta mudah dalam menginterpretasikan hasil
yang diperoleh. Metode spektrofotometri umumnya membandingkan absorbansi yang
dihasilkan oleh suatu larutan yang diuji dengan absorbansi larutan baku.
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis
spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet
dekat (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm) dengan memakai instrumen
spektrofotometer.
Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan
transisi elektronik, yaitu promosi electron-electron dari orbital keadaan dasar
yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Energi
yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau tersalurkan dalam reaksi
kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet meningkatkan energi
elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton
memungkinkan electron-electron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar
ke orbital baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap
radiasi dalam daerah UV-tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu
maupun menyendiri, yang dapat dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi.
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium
maupun wolfram yang bersifat polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke
monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer.
Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya
monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian
akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi
tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada
pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh
detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui
cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan
konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui
konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.
Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik
yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis
lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum
UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari
analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.
Hukum Lambert Beer menyatakan hubungan
linieritas antara adsorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding
terbalik dengan transmitan. Ada beberapa pembatasan dalam hukum Lambert Beer,
yaitu :
-
Sinar yang digunakan
dianggap monokromatis
-
Penyerapan terjadi
dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama
-
Senyawa yang menyerap
dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan
tersebut
-
Tidak terjadi
fluorosensi atau fosforisensi
-
Indeks bias tidak
tergantung pada konsentrasi larutan
Hukum Lambert-Beer
dinyatakan dalam rumus :
A = ε.b.c
dimana :
A = absorban
ε = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Dalam penentuan kadar suatu sampel menggunakan
spektrofotometri visibel perlu dibuat larutan standar. Pembuatan
larutan standar diawali dengan pembuatan larutan baku dimana larutan baku
merupakan larutan yang dibuat dari pengenceran larutan induk menggunakan pelarut tertentu,
larutan ini berfungsi untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi yang
lebih rendah. Tujuannya adalah untuk membuat kurva kalibrasi yang
nantinya akan digunakan untuk menghitung kadar sampel.
Pada metode
spektrofotometri, sampel diletakkan di dalam kuvet yang disinari oleh cahaya UV
dengan panjang gelombang yang sama dengan molekul. Analisis dengan menggunakan
metode ini memiliki hasil yang akurat. Karena alasan biaya, metode ini jarang
digunakan.
Analisis kualitatif dengan
metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai untuk data sekunder atau data
pendukung. Pada analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis yang
dapat ditentukan ada 2 yaitu :
• Pemeriksaan kemurnian
spektrum UV-Vis.
• Penentuan panjang
gelombang maximum.
Sebelum melakukan analisis
dengan spektrofotometri UV-Vis maka perlu dilakukan pemilihan panjang gelombang
maksimum, hal ini dimaksudkan agar pada saat pengukuran absorbansi cuplikan
nanti bias didapat absorbansi maksimum sehingga kepekaan yang diperoleh
maksimum. Untuk keperluan analisis terlebih dahulu dibuat kurva kalibrasi.
Menurut Gandjar
(2007), ada beberapa hal yang harus
diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk
senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri
visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa
yang berwarna. Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif
adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.
Metode
spektrofluorometri adalah suatu metode
pengukuran berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala
dari suatu molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan
panjang gelombang yang lebih panjang. Fluroresensi akan nampak jelas apabila
penyerapan sinar pada daerah ultraviolet dan melepaskannya dalam daerah
gelombang nampak. Apabila struktur molekul bahan organik dapat dipakai untuk
memperkirakan spectrum serapannya, hal yang sama tidak dipakai untuk
memperkirakan senyawa apa yang berfluorosensi. Tetapi ada sedikit petunjuk
bahwa senyawa alifatis cenderung memecah sinar dan tidak berfluoresensi,
senyawa aromatis yang berisi electron tertentu yang tidak ditempat normalnya
akan berfluoresensi.
Radiasi yang dilepaskan dapat berkisar pada beberapa
panjang gelombang, maka spectrum fluoresensi berupa kumpulan atau pita
spectrum. Spektrum fluoresensi biasanya tidak tergantung panjang gelombang
radiasi yang terserap. Spectrum fluoresensi hanya dapat memberikan informasi
pada saat kurang dari 10-8 detik. Intensitas dapat berkurang antara 10 – 15 %
apabila suhu sampel menurun dari 30oC menjadi 20oC, maka
diperlukan pengatur suhu agar pengukuran dapat lebih tepat.
Pada fluorometri larutan zat disinari dengan sinar
yang panjang gelombangnya di sekitar panjang gelombang penyerapan maksimum yang
berasal dari lampu raksa atau lampu pijar yang telah disekat dengan filter.
Intensitas fluoresensi diukur atau dibandingkan dengan intensitas larutan baku.
Sinar fluoresensi dibebaskan dari sinar hamburan dengan melewatkan sinar
melalui filter atau monokromator. Cara pengukuran pada daranya sama dengan cara
spektrofotometri. Karena zat organik yang berfluoresensi mungkin terurai secara
fotokimia, penyinaran harus dilakukan sesingkat mungkin. Oleh karena daerah
dimana intensitas fluoresensi sebanding dengan kadar umumnya sangat sempit,
maka perbandingan tidak boleh kurang
dari 0,40 dan tidak boleh lebih dari 2,50.
Keterangan :
a =
pembacaan intensitas fluoresensi larutan baku
b =
pembacaan intensitas fluoresensi larutan blangko untuk zat baku
c =
pembacaan intensitas fluoresensi larutan uji
d =
pembacaan intensitas fluoresensi larutan blangko untuk zat uji
Peralatan pokok spektrofluorometer adalah :
-
Sumber spectrum yang kontinyu
misalnya dari jenis lampu merkuri atau xenon.
-
Monokromator (M1) untuk menyinari
sampel dengan panjang gelombang tertentu.
-
Monokromator kedua (M2) yang pada
iradiasi konstan dapat dipakai menentukan panjang gelombang spectrum
fluoresensi sampel.
-
Detector berupa fotosel yang sangat
peka misalnya fotomultiplier merah untuk panjang gelombang lebih besar dari
pada 500 nm.
-
Amplifier untuk mengandakan radiasi
dan meneruskan ke pembacaan.
Keuntungan menggunakan spektrofluorometer
yaitu dapat mengukur konsentrasi sampel yang rendah (pikogram). Kepekaan
fluorimetri dapat diatur dengan penguatan aliran listrik yang terbentuk dari
jalinan fotosel. Spektroflurorimetri sangat mungkin menggunakan spectrum
pilihan yang lebih luas karena geseran Stokes dan adanya dua monokhromator yang
dapat dipakai, atau untuk spectrum yang mengenai sampel dan yang lain untuk
spectrum fluroresensi yang timbul. Untuk fluorimetri tidak diperlukan kuvet
pembanding (referensi) tapi kurva kalibrasi tetap harus dibuat.
Kelemahan teknik fluorometri yaitu ketergantungan pada
keadaan lingkungan dan tidak ada pegangan senyawa apa yang akan berfluoresensi.
Masalah lain dalam fluorimetri adalah penghapusan (quenching) yaitu energi yang
seharusnya dilepas sebagai sinar fluoresensi terserap oleh molekul lain. Atau
sebaliknya bahan-bahan diluar sampel seperti bahan pencuci (detergent), minyak
pelumas, kertas saring atau kertas lap dapat mempengaruhi pengukuran
fluorimeter karena dapat melepas sinar fluoresensi sendiri.
Aplikasi Fluorometri yaitu :
-
Analisa kualitatif, perbandingan
spectrum fluoresensi dapat membantu pengenalan senyawa.
-
Analisa kuantitatif, pengukuran
dapat dilakukan pada kadar yang sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan,
dan kepekaan tinggi. Bila panjang gelombang emisi dan eksitasi telah dipilih,
maka dapat dibuat hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi
senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung dari tingkat konsentrasi senyawa.
Hubungan tersebut berupa garis lurus (linier) pada konsentrasi sangat rendah.
Apabila kadarnya terlalu tinggi, larutan tersebut tidak linier lagi karena akan
menyerap sebagian sinar eksitasi.
-
Uji enzim dan analisa kinetika, enzim
hidrolase dapat dengan mudah diukur melalui kecepatan munculnya senyawa yang
berflurosensi pada 450 nm.
-
Reaksi NAD+ dan NADP+, enzim dapat
dilihat dalam keadaan aslinya (invitro), misalnya kadar substrat enzim atau
kofaktor yang sangat rendah.
-
Uji struktur protein. Beberapa jenis
protein mengandung khromofore yang berfluoresensi (misalnya tirosin dan FAD),
maka protein juga berfluoresensi.
-
Penunjuk fluoresensi dan uji
struktur membrane, Sifat fluoresensi molekul berubah oleh gerak maupun arah
gerak (polaritas) lingkungannya, maka deteksi senyawa fluoresensi dapat
memberikan petunjuk lingkungannya.
-
Mikrosspektrofluorimetri. Gabungan
antara spektrofluorimetri dengan mikroskop dapat dipakai untuk menunjukkan
tempat senyawa berfluoresensi pada sel yang mengikat cat fluoresensi.
Spektrofotometri
Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi
elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75–1.000 µm atau
pada bilangan gelombang 13.000–10 cm-1 dengan menggunakan suatu alat
yaitu Spektrofotometer Inframerah.
Metode
ini banyak digunakan pada laboratorium analisis industri dan laboratorium riset
karena dapat memberikan informasi yang berguna untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif, serta membantu penerapan rumus bangun suatu senyawa.
Agar
terjadi peresapan radiasi inframerah, maka ada beberapa hal yang perlu
dipenuhi, yaitu :
1)
Absorpsi terhadap
radiasi inframerah dapat menyebabkan eksitasi molekul ke tingkat energi vibrasi
yang lebih tinggi dan besarnya absorbsi adalah terkuantitasi
2)
Vibrasi yang normal
mempunyai frekuensi sama dengan frekuensi radiasi elektromagnetik yang diserap
3)
Proses absorpsi
(spektra IR) hanya dapat terjadi apabila terdapat perubahan baik nilai maupun
arah dari momen dua kutub ikatan
Interaksi antara sinar infra merah
dengan molekul hanya menyebabkan vibrasi, yaitu bergerak pada tempatnya. Dasar
spektrofotometri infra merah digambarkan oleh Hook, dimana didasarkan atas
senyawa yang teriri dari 2 atom atau diatom yang mana digambarkan dengan dua
buah bola yang saling terikat oleh pegas seperti berikut:
Keterangan
:
v
= frekuensi vibrasi (cm-1)
c
= kecepatan cahaya (cm/sec)
k
= force constant of bond (dynes/cm)
m
= massa atom (g)
Atom – atom di dalam molekul tidak dalam keadaan diam, tetapi biasanya
terjadi peristiwa vibrasi. Hal ini bergantung pada atom – atom dan kekuatan
ikatan yang menghubungkannya. Vibrasi molekul sangat khas untuk suatu molekul
tertentu dan biasanya disebut finger print. Vibrasi molekul dapat digolongkan
atas dua golongan besar, yaitu:
a.
Vibrasi regangan (Streching),
adalah peristiwa bergeraknya atom terus sepanjang ikatan yajng menghubungkannya
sehingga akan terjadi perubahan jarak antara keduanya, walaupun sudut ikatan
tidak berubah. Vibrasi regangan ada dua, yaiut regangan simetri (unit struktur
bergerak bersamaan dan searah dalam satu bidang datar) dan regangan asimetri
(unit struktur bergerak bersamaan dan tidak searah tetapi masih dalam satu
bidang datar).
b.
Vibrasi Bengkokan (Bending)
Jika
sistem tiga atom merupakan bagian dari sebuah molekul yang lebih besar, maka
dapat menimbulkan vibrasi bengkokan atau vibrasi deformasi yang mempengaruhi
osilasi atom molekul secara keseluruhan. Vibrasi bengkokan ini terbagi menjadi
empat jenis, yaitu: Vibrasi goyangan(rocking), vibrasi guntingan (Scissoring),
vibrasi kibasan (Wagging), vibrasi pelintiran (Twisting).
Radiasi
inframerah digolongkan atas 4 (empat) daerah, yaitu :
No.
|
Daerah Inframerah
|
Panjang Gelombang dalam µm
|
Bilangan
Gelombang
(cm-1
)
|
Frekuensi (Hz)
|
1
|
Dekat
|
0,78-2,5
|
13.000-4000
|
3,8-1,2 (1014)
|
2
|
Pertengahan
|
2,5-50
|
4000-200
|
1,2-0,06 (1014)
|
3
|
Jauh
|
50-1000
|
200-10
|
6,0-0,3 (1014)
|
4
|
Untuk analisis instrumen
|
2,5-1,5
|
4000-670
|
1,2-0,2 (1014)
|
Spektrofotometri
IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama
senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan
adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Kesimpulan
dalam makalah ini yaitu :
-
Spektrofotometri UV-Vis adalah
anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi
elektromagnetik) ultraviolet dekat (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm)
dengan memakai instrumen spektrofotometer.
-
Metode spektrofluorometri adalah suatu metode
pengukuran berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala
dari suatu molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan
panjang gelombang yang lebih panjang. Fluroresensi akan nampak jelas apabila
penyerapan sinar pada daerah ultraviolet dan melepaskannya dalam daerah
gelombang nampak.
-
Spektrofotometri Infra
Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi
elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75–1.000 µm atau
pada bilangan gelombang 13.000–10 cm-1 dengan menggunakan suatu alat
yaitu spektrofotometer inframerah.
Sebaiknya mahasiswa dapat memahami
dengan baik tentang spektroskopi baik spektrofotometri UV-Vis, fluorometri,
maupun Infra Red agar dapatmengaplikasikannya dengan benar.
Gandjar, I.B. & Abdul R., 2007, Kimia
Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Hal 252.
Ika,
D., 2009, Alat
Otomatisasi Pengukur Kadar Vitamin C dengan Metode Titrasi Asam Basa,
Jurnal Neutrino, No. 2, Vol. 1.
Karinda, M., dkk, 2013, Perbandingan Hasil Penetapan
Kadar Vitamin C Mangga Dodol Dengan Menggunakan Metode Spektrofotometri Uv-Vis Dan Iodometri, Pharmacon, vol. 2 no. 1, ISSN 2302 – 2493, Manado.
Liyana, D.E. & Djarot S., 2010, Optimasi pH Buffer dan Konsentrasi Larutan Pereduksi Natrium Tiosulfat
(Na2S2O3) Dan Timah (II) Klorida (SnCl2)
Dalam Penentuan Kadar Besi Secara Spektrofotometri UV – Vis, Prosiding
Tugas Akhir Semester Genap 2010/2011, Institut Teknologi Sepuluh Nopember.
Putro, P.K. & Asmedi S., 1996, Studi
Banding Analisis Silicon Di Dalam Bahan Bakar Uranium Silisida Secara
Spektrofoometrik Dan Gravimetrik, Prosiding Presentasi Ilmiah Dasar Bahan
Bakar Nuklir, ISSN 1410-1998.
Sudarmadji,
S., 1996, Teknik Analisa Biokimia,
Penerbit Liberty, Yogyakarta.
Triyati, E., 1985, Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak serta Aplikasinya dalam
Oseanologi, Oseana, vol. X, No.1,
ISSN 0216-1877, Jakarta.